A.
Latar Belakang
Kromatografi adalah
suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang
didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas
ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan.
Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan
pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4).
lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang
berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T.
Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum,
namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan
tentang proses kromatografi.
Macam kromatografi yang
dapat digunakan untuk memisahkan campuran zat-zat kimia yang terkandung dalam
tumbuhan antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi
kertas, kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi.
HPLC adalah metode
kromatografi yang menggunakan fase gerak cair dan fase diam padat/bahan
pendukung untuk melakukan pemisahan suatu jenis molekul. Terdapat dua variasi
utama yaitu, HPLC yang terdiri dari eluen polar dan fase diam non-polar atau
eluen non-polar dan fase diam polar. Keduanya diklasifikasikan sebagai
metodereversed-phase dannormal-phase. Metode reversed-phase yang akan dipakai
dalam eksperimen ini menggunakan kolom octadecylsilane (ODS) dan partisi
absorptif (dapat menyerap) utnuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
Pada akhir
tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi
cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High
Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan
Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam
keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit
untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan
pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik
yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat
dengan kromatografi gas.
B.
Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah
pada makalah ini, yaitu :
1.
Bagaimana kinerja kromatografi
padat-cair (adsorpsi) ?
2.
Bagaimana kinerja kromatografi cair-cair ?
3.
Bagaimana kinerja KCKT ?
4.
Bagaimana kinerja kromatografi penukar ion ?
5.
Bagaimana kinerja Kromatografi Eksklusi/ Permeasi Gel (GPC) ?
C.
Tujuan
Adapun tujuan makalah
ini, yaitu :
1.
Untuk mempermudah proses belajar metode pemisahan
kimia terutama kromatografi.
2. Untuk
mengetahui cara pemisahan campuran berdasarkan metode kromatografi padat-cair (adsorpsi),
kromatografi cair-cair, KCKT, kromatografi penukar ion dan Kromatografi Eksklusi/ Permeasi Gel
(GPC).
BAB
II
PEMBAHASAN
A.
Kromatografi
Padat-Cair (adsorbsi)
Kromatografi Padat-Cair (adsorbsi) adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi
antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase
diam tidak boleh larut dalam fase gerak.
Umumnya
sebagai fase diam digunakan air dan sebagai fase gerak adalah pelarut organik.
Misalnya pada kromatografi kertas, sebagai fase diam adalah air yang terserap pada
serat selulosa dari kertas.
Kesetimbangan
penyerapan, ketika larutan mengalir melewati permukaan yang
aktif pada benda padat, sebuah kesetimbangan akan terbentuk untuk penyerapan
atau pengeluaran dari spesies tersebut. Hubungan antara konsentrasi yang
diberikan oleh spesies dalam larutan dan jumlah yang diserap dapat digambarkan
sebagai sebuah persamaan atau sebagai proses dari Cs (yang diserap) versus Cm
(fase gerak), sebagaimana dalam gambar 5-2. Garis yang diperoleh disebut
penyerapan isotherm sebagaimana diilustrasikan dalam gambar 5-2.
1.
lurus. Ini merupakan situasi yang diinginkan, ini mengindikasikan bahwa
permukaan tidak “penuh” dengan spesies
lekuk dari garis lurus isotherm memberikan distribusi koefisien dan
dalam hal ini ia bebas dari total konsentrasi.
K
= CS/CM or CS=KCM (5-1)
2.
cembung. Karena variasi dari aktifitas penyerapan pada tempat yang tepat,
sebagian besar susunan menyimpang dari kelurusan. Banyak cairan dan zat padat
mengikuti hubungan yang disebut sebagai isotherm freundlich.
K=CS/CM1/n or CS=
KCM1/n (5-2)
dimana nilai dari
variasi dengan sifat dasar susunan dan temperature, umumnya n>1 yang membuat
menjadi cembung sebagai isotherm seperti yanpg ditunjukkan pada figure 5-2a.
kebanyakan susunan gas dan zat padat kecepatan meyerap sesuai dengan daerah
uang kosong sampai seluruh permukaan tertutupi dengan lapisan mono pada
penyerapan spesies.
Time
Gambar 5.1
Bentuk Isotherm untuk penyerapan dan Dampaknya pada Puncak Kurva
Demikian,
kecepatan harus dikurangi sebagaimana konsentrasi ditingkatkan. Sebagai contoh,
pada persamaan penyerapan reaksi kimia:
(5-1)
Dimana
A adalah molekul yang diserap dari fase gas, S adalah tempat penyerapan yang
kosong dan AS adalah molekul yang diserap oleh A. Kesetimbangan digambarkan
dalam reaksi berikut:
K =
(5-3)
Dimana
XA adalah fraksi mol A dan PA adalah tekanan. Dengan
menggunakan persamaan rumus umum fraksi mol :
or
(5-4)
Kemudian
untuk menghitung seluruh bagian, nilai XAS
pada persamaan rumus (5-4), disubstitusi ke persamaan rumus (5-3), sehinggadiperoleh
:
K=
(5-5)
Dengan
mengubah fraksi mol menjadi konsentrasi, maka kita mendapatkan:
Cs =
(5-6)
Dimana
: K = Kapasitas absorben
Cs
= Konsentrasi fase diam
Cm = Konsentrasi fase gerak
PA
= Tekanan
X
= Fraksi mol
k = Konstanta tiap susunan
Persamaan
5-5 (5-6) disebut sebagai isotherm
Langmuir dan juga menuntun pada isotherm convex yang meningkatkan nilai
yang terbatas pada monolayer.
3.
cekung, tambahan reaksi yang mengambil
tempat pada penyerapan biasanya mempertinggi proses penyerapan secara
keseluruhan. Beberapa kasus tidak umum, tetapi tidak diketahui. Penyerapan
isotherm membelok keatas seperti pada figure 5-2c.
Penyerapan.
Relatifnya beberapa jenis bahan yang digunakan dalam penyerapan kromatografi gel silica dan aluminia adalah yang
terpopuler. Kekuatan penyerapan bahan tergantung pada sifat dasar bahan kimia
di permukaannya, area yang tepat, dan perlakuan yang diberikan. Sifat-sifat ini
mudah untuk dimodifikasi tapi sulit untuk dikontrol, sehingga, urutan yang
diberikan dalam tabel 5-1 tidak selalu dapat diamati.
Alumina calcium carbonate
Charcoal sucrose
Silica gel starch
Magnesia powdered cellulose
|
Tabel
5-1 Beberapa adsorbent secara umum disusun menurut
penurunan kekuatan adsorptive
Kemampuan
meniru permukaan adalah masalah yang pernah muncul dalam kromatografi. Aktifitas permukaan kebanyakan
menyerap beberapa macam dari tempat satu ke tempat lain dengan partikel yang
sama dan dari kumpulan satu ke kumpulan lain.
Alumina.
Aktifitas penyerapan alumina dapat dikontrol dengan merubah-rubah jumlah
kandungan airnya. Sehingga kita dapat mempersiapkan penyerapan yang sesuai
dengan menurunkan pada 360°C selama 5 jam dan membiarkan bahan tersebut kering
untuk menyerap dapat sejumlah air yang sesuai. Skala aktifitas Brockman
berdasarkan jumlah air yang dikandung aluminia mengandung: I 0% H2O,
II 3%, III 6%, IV 10%, V 15%. Nilai skala dapat ditentukan secara empiris
melalui pengamatan sifat Kromatografi dari campuran Azo dye dibawah pengontrolan
kondisi yang hati-hati.
Silica Gel. Walaupun silica gel mempunyai daerah permukaan yang lebih tinggi
( ca.500 m2/g), secara kimiawi kurang aktif dibanding oksid
aluminium dan lebih disukai untuk pemisahan campuran organik yang sensitif ke
penyusunan kembali pada permukaan katalitis yang aktif.
Pelarut. Pemilihan suatu bahan pelarut eluting sama pentingnya seperti
pemiilihan adsorbent, fasa gerak cairan tidak hanya menyediakan transportasi
sebagai pengangkut, tetapi juga mempengaruhi koefisien distribusi melalui
pelarut penggerak. Dalam penambahan terhadap daya larut relatif dari zat
terlarut dalam pelarut eluting, diperlukan untuk mempertimbangkan kompetisi
antara zat terlarut dan zat pelarut untuk lokasi penyerapan pada atas permukaan
dari tahap keperluan.
B. Kromatografi Cair-Cair
Kromatografi
Cair-Cair adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika
gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipakai dalam sebuah kolom
dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak.
Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan
yang masuk golongan ini (www.nadjeeb.wordpress.com).
Fase
kebalikan kromatograpi. Ada beberapa situasi pada dinding
pemisah kromatograpi yang mana menguntungkan untuk menggunakan pelarut organik
nonpolar sebagai fase diam dalam memperoleh banyak nilai yang baik untuk
koefisien dinding pemisah. Secara jelas, dibutuhkan penambahan zat nonpolar
padat. Bubuk karet yang dilapisi benzena adalah fase diam yang sangat memuaskan
dengan sebuah fase gerak yang menghasilkan air.
C.
Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance Liquid Chromatography
(HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan
dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama KCKT pada
dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam
suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh
ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk
kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang
masih menjadi idola didunia analisis saat ini. KCKT digunakan secara luas dalam
pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi,
lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan
baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis
kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan sebuah spektrometri massa
(Mass Spectrometer (MS)), maka penggunaannya akan lebih memungkinkan
dalam analisis kuantitatif.
Secara umum KCKT digunakan dalam
kondisi-kondisi berikut:
- Pemisahan
berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
- Analisis ketidakmurnian (impurities)
- Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
- Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter
ion
- Isolasi dan pemurnian senyawa
- Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia
yang mirip
- Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace
elements)
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan
dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:
·
mampu memisahkan
molekul-molekul dari suatu campuran
·
mudah melaksanakannya
·
kecepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi
·
dapat dihindari terjadinya
dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
·
Resolusi yang baik
·
dapat digunakan
bermacam-macam detektor
·
Kolom dapat digunakan
kembali • mudah melakukan "sample recovery"
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
yang lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cairan kinerja tinggi
(KCKT) merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif
maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai
titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara
kromatografi gas.
Prinsip
pemisahan HPLC sama dengan prinsip kromatografi
pada umumnya yaitu berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi
kesetimbangan (K) dari 2 komponen yang berbeda fasanya (fasa diam dan fasa
gerak). HPLC terdiri dari fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan,
resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta
dialiri fase gerak cair dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada temperatur rendah serta dengan adanya
kompetisi 2 fase (gerak dan diam). Migrasi dari molekul komponen akan sebanding
dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada
fase diam akan bergerak lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah
dari komponen yang distribusinya rendah.
Setiap komponen
campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen,
sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer
dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta
mengolah data hasil pengukuran HPLC.
Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada gambar
berikut:
Gambar 5-2
Gambar Komponen-Komponen KCKT
a.
Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu
cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu
kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant
displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating
dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut
teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam
elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil,
bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran
reservoir tidak terbatas.
Pompa syringe memberikan aliran yang
tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
b.
Injektor
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian
ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua
model umum : a. Stopped Flow b. Solvent Flowing Ada tiga tipe dasar injektor
yang dapat digunakan :
1.
Stop-Flow: Aliran
dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan
aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
2.
Septum: Septum yang
digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor
ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak
tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum
yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3.
Loop Valve: Tipe injektor
ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 µ dan
dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume
yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel
diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel
akan masuK ke dalam kolom.
c.
Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi.
Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan
kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
1.
Kolom analitik : Diameter
dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.
Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk
kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar
dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan
biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan
temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan
kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang
digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC;
Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC).
d.
Detektor (Detector)
Suatu detektor dibutuhkan untuk
mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan
menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier
yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang
rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak
selalu dapat diperoleh.
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah
detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi
banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga
digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya
kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya
antara lain:
·
Detektor Fluorometer
·
Detektor Spektrofotometer
Massa Detektor lonisasi nyala
·
Detektor Refraksi lndeks
Detektor Elektrokimia
·
Detektor Reaksi Kimia
e.
Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai
penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek
dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang
tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
1.
Total waktu analisis dapat
direduksi
2.
Resolusi persatuan waktu
setiap senyawa dalam campuran bertambah
3.
Ketajaman Peak bertambah
(menghilangkan tailing)
4. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien
dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih
dengan cara trial and error. Tabel 5-2. berikut ini menunjukkan kompatibilitas
dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam
praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
Tabel
5.-2 : Mode Kompatibilitas dengan Gradien
f. Pengolahan Data (Data Handling)
Hasil dari pemisahan kromatografi
biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder. Suatu tipe
Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3. 2 berikut ini.
Gambar
5-3 : kromatogram dari senyawa 5’ Nukleotida
Dari
Gambar 5-3 waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa
digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi
kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau
proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil
secara kuantitatif.
g.
Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi
dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi
pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk
KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak
harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable
price)
Umumnya, semua solven yang sudah
digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat
membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1)
s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan
gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa
bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak
tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan
menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh
tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing)
juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara
(contoh : kolom berikatan dengan NH2).
h.
Keuntungan KCKT
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap
Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk
memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan
pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis.
Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan
utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan
peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga
menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah
sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan
dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain:
·
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang
dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
·
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa
diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan
rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan
yang diinginkan.
·
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat.
Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
·
Kolom yang dapat
digunakan kembali : Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak
analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel
yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
·
Ideal untuk zat
bermolekul besar dan berionik : zat –
zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya
diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan
penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
·
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati
detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
i.
Seleksi Tipe KCKT
Analisis (pengguna KCKT) sebelum
mengoperasikan KCKT, harus membuat keputusan tipe yang mana yan gharus dipilih
yang dapat memberikan informasi yang diinginkan. Skema I : Seleksi tipe KCKT
adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi tipe KCKT. Informasi ini akan
memudahkan para analis untuk memutuskan pemelihan tipe KCKT yang memberikan
para analis untuk memutuskan pemilihan tipe KCKT yang memberikan kemungkinan terbaik
pada pemisahaan yang diinginkan. Namun, sampel yang tidak dikenal (unknown)
akan menyulitkan pemilihannya tipe KCKT.
Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya Berat
Molekul dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data
spektroskopik seperti nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infra red
spectrophotometer, ultra violet spectrumeter, dan mass Spectrophotometer. Semua
data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk bagi analis memilih tipe HPLC
yang tepat untuk digunakan.
Skema 1 :
Seleksi tipe KCKT
Dengan berpedoman pada Hukum Dasar
"like dissolves like" maka sangat mudah untuk memutuskan tipe KCKT
yang akan dipilih. Dari Skema 1 : Seleksi tipe KCKT, dengan cepat kita dapat
melihat bahwa Berat Molekul (BM) lebih besar dari 2000, maka kita dapat
menggunakan kromatografi eksklusi. Fasa geraknya adalah air jika sampelnya
larut dalam air; bila dapat larut dalam pelarut organik maka digunakanpelarut-
pelarut organik sebagai rasa gerak. Fasa diamnya adalah Sephadex atau (Bondagel
Seri E untuk rasa gerak air dan Styragel atau MicroPak TSK gel untuk rasa gerak
organik. Bila BM lebih rendah dari 2000, pertama yang harus ditentukan
adalah apakah sampel dapat larut dalam
air. Bila sampel dapat larut dalam air, maka kromatografi partisi rasa terbalik
atau kromatografi penukar ion dapat digunakan. Bila kelarutan dipengaruhi oleh
penambahan asam atau basa atau bila pH larutan bervariasi lebih dari 2 (dua)
satuan pH dari pH 7, maka kromatografi penukar ion adalah pilihan utama. Bila
kelambatan tidak dipengaruhi oleh asam dan basa dan larutan sampel adalah
netral, maka kromatografi partisi rasa terbalik adalah pilihan terbaik. Tipe
Eksklusi menggunakan ukuran poros yang kecil dan rasa air dapat juga dicoba.
Bila
sampel tidak larut dalam air, kromatografi partisi atau kromatografi padat cair
dianjurkan untuk digunakan. Untuk pekerjaan rutin disarankan menggunakan
kromatografi partisi fasa terikat normal karena kolom-kolom ini tidak begitu
rumit dalam perawatannya setelah digunakan. Untuk sampel-sampel isomer
kromatografi padat cair lebih baik digunakan. Bila sampel memiliki perbedaan
ukuran partikel yang besar, kromatografi eksklusi sterik dengan fasa gerak
organik dapat juga digunakan.
D.
Kromatografi Penukar
Ion (IEC)
Teknik
ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan
tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari
kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah.
Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik
untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini
digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam
amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion
E.
Kromatografi Eksklusi /
Permeasi Gel (GPC)
Teknik ini unik karena dalam pemisahan
didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan
permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul
kecil dapat masuk dalarn jaringan danditahan dalam fase gerak yang menggenang
(stagnat mobile phase). Molekul- molekul
yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom
tanpa ditahan.
Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak
nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun
namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu
Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan
semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel
lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini
dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama
digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.
Kromatografi pertukarann molekul atau
sering disebut dengan kromatografi permeasi gel (GPC) merupakan metode
kromatografi baru, meliputi kromatografi eksklusi, kromatografi
penyaring gel, dan kromatografi permeasi gel. Metode ini dapat digunakan
terhadap suatu cuplikan yang larut dan penggunaan utama kromatografi gel biasanya
dalam salah satu dari tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat berguna
untuk untuk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM
>2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap makro molekuler seperti protein dan
asam nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan
distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat
dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel,
terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat berbeda.
Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan
eksplorasi dari cuplikan yang tak diketahui.
Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu
memiliki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi.
Kromatografi gel memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya:
1.
Pita-pita sempit
2.
Waktu pemisahan pendek, mudah diramalkan
3.
Tidak terjadi kehilangan cuplikan
atau reaksi selama pemisahan.
4.
Hanya terjadi sedikit masalah
dalam deaktivasi kolom.
Kromatografi
gel juga memiliki kelemahan
1.
Kapasitas terbatas
2.
Tidak dapat digunakan untuk
cuplikan yang mempunyai ukuran hampir sama.
3.
Prinsip pemisahan tidak seperti
kromatografi lain.
Kekurangan yang
paling menonjol adalah kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti hanya ada
sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogram total,
karena kromatogram cukup pendek semua senyawa terelusi sebelum total. Pada kromatografi gel jarang terlihat lebih dari enam
pita pada satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi gel
biasanya tidak dapat memisahkan secara sempurna suatu cuplikan kompleks, tanpa
pemisahan lebih lanjut dengan metode lain.
Kekurangan kedua adalah tidak dapat
memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai ukuran hampir sama. Perbedaan pada
kromatografi gel adalah prinsip pemisahan yang berbeda denganyang digunakan
metode kromatografi lain. Konsep factor pemisahan α, dan factor kapasitas k’ tidak bisa digunakan. Susunan fasa
gerak juga relative tidak penting pada kromatografi gel.
Pengelompokkan
berbagai penggunaan kromatografi gel biasanya dibagi dalam dua teknik yaitu
teknik filtrasi gel (pelarut air) dan kromatografi permeasi gel (pelarut
organik).
BAB III
KESIMPULAN
1.
Kromatografi Padat-Cair (adsorbsi) adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi
antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair.
2.
Kromatografi Cair-Cair
adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina,
penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana
komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak.
3.
KCKT merupakan
teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif
yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi
yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.
4.
Kromatografi
Penukar Ion tergantung pada penukaran
(adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak.
5.
Kromatografi
Eksklusi/ Permeasi Gel (GPC) merupakan
pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat.
DAFTAR PUSTAKA
Robert
I. Pesok. 1968. Modern Methods Of Chemical Analysis Second Edition.
University Of Hawaii.
2K2CrO4 + 9H2O2 + 2 KOH 2K3[Cr(O2)4]
+ O2 + 10H2O
T :
0,003 mol 0,003 mol 0,003 mol
